Construção, caracterização, antigenicidade e imunogenicidade de proteína multiepítopo dos Alphaherpesvirus bovinos 1 e 5
Resumo
Os herpesvirus bovinos são importantes microrganismos causadores de distúrbios
respiratórios, reprodutivos e encefálicos que ainda acometem as criações de bovinos
em todo o mundo, podendo também afetar bubalinos, ovinos e caprinos. A vacinação
é o método mais efetivo de controle e redução das doenças provocadas por esses
microrganismos, e nesse âmbito, diferentes plataformas vacinais têm sido
desenvolvidas ao longo dos anos com essa finalidade. O objetivo deste estudo foi o
desenvolvimento de uma proteína multiepítopo a partir da união de epítopos
imunodominantes das glicoproteínas B, C e D dos BoAHVs 1 e 5, e sua avaliação para
utilização em teste diagnóstico e vacinação de bovinos sob condições de campo.
Inicialmente foi realizada a recuperação (NCBI) e curadoria (MUSCLE e BLASTp) das
sequencias das glicoproteínas dos organismos de interesse, para posterior predição
de epítopos reconhecidos por linfócitos B (BepiPred 2.0), células T citotóxicas
(NetMHCpan EL 4.1) e células T helper (NetMHCIIpan 4.0). Posteriormente à análise
de antigenicidade (VaxiJen 2.0), a proteína multiepítopo, que daria origem à vacina
multiepítopo, foi montada utilizando os ligantes GGGGS e EAAAK entre os epítopos
de uma mesma glicoproteína ou entre os epítopos de glicoproteínas diferentes,
respectivamente. Após, as análises de parâmetros físico-químicos e perfil de
alergenicidade, foram realizadas através dos servidores ProtParam e AlgPred seguida
de uma nova análise de antigenicidade (VaxiJen 2.0). A modelagem e o docking
molecular foram realizados através dos servidores I-TESSER e ClusPro,
respectivamente, com o modelo do receptor TLR bovino obtido através do banco de
dados AlphaFoldDB. Para a expressão da proteína multiepítopo o vetor pET24a
contendo o gene de interesse foi utilizado para transformar a cepa de E. coli BL21
(DE3) Star por choque térmico. O cultivo foi realizado em 500 mL de meio LB líquido
sob condições ideias para o seu crescimento e expressão da proteína multiepítopo.
Em seguida a amostra foi processada e em sequência purificada por cromatografia de
afinidade no equipamento AKTA Purifier, para posterior diálise e quantificação por
BCA. A caracterização foi realizada por Western blotting e a antigenicidade por teste
de ELISA indireto com protocolo in house. A imunogenicidade foi avaliada a partir da
imunização de 5 bovinos com 400 µg da proteína multiepítopo conjugada com o
adjuvante Montanide™ ISA 50 V2, pela via intramuscular (vacina multiepitopo). O
grupo placebo foi inoculado com solução salina tamponada (PBS). Para determinação
do nível de anticorpos totais IgG, o teste de ELISA indireto, com protocolo in house,
foi empregado. A proteína multiepítopo apresenta 321 aminoácidos, peso molecular
de 33.24 kDa, pI teórico de 9.88, estimativa de meia vida em E. coli de >10 horas,
GRAVY de -0,507, antigenicidade de 1.1543 e se caracteriza como instável e sem
potencial alergênico. A proteína multiepítopo também é capaz de interagir com alta
energia de interação (-1264.7 kcal/mol) com 88 membros do cluster. Suas frações
solúvel e insolúvel foram reconhecidas pelo anti-HIS6x em um Western blotting,
caracterizando-a pelo seu peso molecular de ~33 kDa. A proteína multiepítopo foi
fortemente reconhecida pelos anticorpos IgG-anti-alphaherpesvirus dos soros
bovinos, demonstrando sua antigenicidade. A vacina multiepitopo foi capaz de induzir
uma resposta imunológica humoral a nível de IgG total. A proteína multiepítopo pode
ser utilizada em testes diagnósticos e em vacinas contra os Alphaherpesvirus bovinos
1 e 5.