BioBricks: desenho racional de vacinas de Mycobacterium bovis BCG recombinante
Abstract
Desde a década de 90, Mycobacterium bovis BCG tem sido geneticamente manipulado para utilização como vetor vacinal. Entretanto, a falta de padronização na clonagem de sequências de DNA para a construção de BCG recombinante (rBCG) resulta em protocolos não reprodutíveis e eficácia variada. A estratégia BioBricks permite padronizar a construção de moléculas de DNA pelo uso de sequências prefixo e sufixo que flanqueiam os fragmentos alvo. Nesta tese, a tecnologia BioBricks foi aplicada para desenvolver um kit, chamado de caixa de ferramentas, contendo sequências de DNA de micobactéria importantes para a construção de cepas de rBCG. Além disso, vetores epissomais compatíveis com o padrão BioBricks, capazes de se replicar em BCG, foram desenvolvidos e caracterizados através de microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, utilizando a proteína repórter eGFP. Estes vetores foram aplicados para a expressão de proteínas quiméricas de Leptospira interrogans em rBCG, as quais foram avaliadas como vacinas vetorizadas contra leptospirose em hamsters. O kit construído para micobactéria, utilizando o padrão BioBricks, contém dez promotores, duas sequências codificadoras, um plasmídeo base, um gene repórter, um gene de resistência à canamicina e a origem de replicação em micobactéria. Todas estas sequências de DNA são funcionais e compatíveis entre si. Além disso, a funcionalidade de sete vetores epissomais construídos utilizando diferentes promotores foi demonstrada pela detecção da expressão de eGFP em rBCG cultivado in vitro e no interior de macrófagos. Estes vetores estão disponíveis para expressão de quaisquer antígenos heterólogos em BCG, clonados com o padrão BioBricks. As vacinas vetorizadas por BCG usando os plasmídeos construídos neste estudo foram capazes de proteger hamsters de desafio letal com L. interrogans e do estado de portador renal desta espiroqueta. Juntos, estes resultados representam um avanço para a construção de cepas de rBCG, trazendo praticidade para este processo, e salientam o potencial de BCG como um veículo vacinal contra leptospirose.