Investigação da ecto-5’nucleotidase/cd73 como alvo terapêutico em gliomas
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2014-02-26Metadatos
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Os gliomas são tumores que apresentam características fenotípicas e gênicas de
células da glia. A ecto5’nucleotidase/CD73 (5’-NT/CD73) é considerada enzima
marca-passo do sistema purinérgico responsável pela hidrólise de AMP em
adenosina e apresenta expressão aumentada em tumores sólidos. Estudos de
silenciamento da expressão gênica utilizando a ferramenta de RNA de
interferência (siRNA) têm sido propostos como novas alternativas terapêuticas.
Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de inibidores da atividade
enzimática e da expressão da 5’-NT/CD73 como alvo terapêutico em gliomas.
Para avaliar o efeito do inibidor AMPCP (adenosina 5′-(α,β-metileno) difosfato)
sobre a proliferação celular foi utilizado o método de contagem celular e para
determinar a hidrólise de AMP em células C6 foi utilizado o método do verde de
malaquita. Para a realização do silenciamento da expressão gênica, duas
sequências de RNA de interferência inéditas para a 5’-NT/CD73 foram
desenhadas e nanoemulsões (NE) foram utilizadas como carreadoras. A
citotoxidade da NE em cultura primária de astrócitos e em linhagem celular de
glioma C6 foi determinada pelo método do MTT. Para caracterizar as propriedades
físico-químicas do complexo formado pela NE e siRNA-CD73 foram analisados
parâmetros de tamanho de partícula, potencial zeta e índice de polidispersão
utilizando o aparelho Zetasizer e imagens da complexação entre NE e siRNA
foram captadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A eficiência do
silenciamento promovida pela transfecção dos complexos NE-siRNA-CD73 em
glioma C6 foi determinada pela avaliação da atividade AMPásica e pela análise da
expressão da 5’-NT/CD73 por imunocitoquímica e por citometria de fluxo utilizando
anticorpo específico. A avaliação do efeito antiproliferativo dos complexos NEsiRNA-CD73 em glioma C6 foi realizada por MTT. Os resultados obtidos nessa
dissertação estão de acordo com a hipótese do trabalho, onde o AMPCP reduziu a
proliferação celular de glioma C6 a qual foi acompanhada pela inibição da hidrólise
de AMP. As sequências de siRNA-CD73 foram eficientes em promover o
silenciamento da 5’NT/CD73 e a formulação da NE também mostrou boa
capacidade de complexação com os oligonucleotídeos, apresentando baixa
toxicidade em células normais e seletividade para células tumorais. Observou-se
que o complexo NE-siRNA-CD73 foi eficaz para silenciar a enzima e para reduzir a
atividade AMPase e a viabilidade glioma C6. É importante notar que o sistema
nanoestruturado (NE) foi eficaz tanto em complexar com oligonucleotídos como
para entrega-los nas células-alvo. No entanto, existe uma necessidade de novos
estudos para compreender o efeito do tratamento do complexo NE-CD73-siRNA
sobre o crescimento do tumor in vivo. Por fim, os nossos dados indicam a primeira
vez que o potencial de siRNA-CD73 nanoemulsão carregada como uma
alternativa terapêutica para o tratamento de GBM. Apesar disso há necessidade
de estudos adicionais para compreender o efeito do tratamento dos complexos
NE-siRNA-CD73 sobre o crescimento tumoral in vivo.