Multiplex PCR para identificação de S. aureus, S. intermedius e S. hyicus.
Fecha
2008-07-02Metadatos
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Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus e Staphylococcus intermedius são
espécies do gênero Staphylococcus com capacidade de produzir enterotoxinas, bem
como as enzimas termonuclease e coagulase, sendo denominadas de Estafilococos
Coagulase Positiva (ECP). Apresentam características morfológicas e bioquímicas
extremamente semelhantes, o que torna difícil sua diferenciação assim como sua
identificação em alimentos através de técnicas fenotípicas de análise microbiológica.
Dessa forma, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um Multiplex
PCR (mPCR), tendo-se como alvo o gene nuc (codifica para a termonuclease), para
a identificação de S. aureus, S. intermedius e S. hyicus. Inicialmente, o mPCR foi
padronizado utilizando-se cepas padrão de S. aureus, S. warneri, S. lugdunensis e
Listeria monocytogenes e isolados de S. hyicus e S. intermedius, e, posteriormente,
foi testado em 16 isolados das três espécies de ECP. Foram avaliadas a
sensibilidade dos primers para cada uma das três espécies, as condições da mPCR,
a sensibilidade do Controle Interno de Amplificação (IAC) para o gênero
Estafilococos, e as seqüências obtidas através da amplificação por PCR.
Posteriormente, os resultados foram comparados aos obtidos com testes
bioquímicos de diferenciação de ECP. Foram utilizados os primers NUC1-NUC2
(para seqüências do gene nuc de S. aureus), NUC5-NUC6 (para seqüências do
gene nuc de S. intermedius), NUC7-NUC8 (para seqüências do gene nuc de S.
hyicus) e, para amplificação do IAC, os primers 16S1 16S2 (para seqüências do
gene 16S do rRNA). O mPCR proposto possibilitou a identificação das espécies S.
aureus, S. hyicus e S. intermedius, bem como o IAC utilizado apresentou
sensibilidade para o gênero. As seqüências obtidas na PCR apresentaram elevado
v
grau de similaridade com as seqüências do gene da termonuclease depositadas no
GenBank. A mPCR apresentou maior poder discriminatório que os testes
bioquímicos para identificação de S. aureus, S. hyicus e S. intermedius, bem como
reduziu significativamente o tempo necessário para a identificação de ECP (redução
de 24h) ou de identificação em nível de espécie (redução de 72h).