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Anticorpos Monoclonais contra Listeria spp.: Produção, Caracterização e Aplicação em Métodos Diagnósticos

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tese_marcelo_mendonca.PDF (4.010Mb)
Data
2011-12-01
Autor
Mendonça, Marcelo
Metadata
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Resumo
Os métodos convencionais empregados para detecção de Listeria monocytogenes em alimentos são laboriosos e onerosos, requerendo vários dias para sua identificação final. A utilização de anticorpos monoclonais (MAbs) em imunoensaios para detecção rápida de bactérias tem como vantagem a alta especificidade e rapidez, principalmente quando direcionados para fatores de virulência conservados. Dentre os diversos fatores de virulência de Listeria, a proteína de membrana internalina A (InlA), é umas das mais bem caracterizadas, sendo um excelente alvo por ser altamente exposta na superfície e exclusiva de espécies patogênicas. Neste trabalho é relatado a produção, caracterização e utilização em métodos de diagnósticos de um painel de MAbs contra a InlA (2D12, 3B7, 4E4), e de um MAb (3F8) que reconhece especificamente todas as bactérias do gênero Listeria. Na produção dos MAbs, camundongos BALB/c foram imunizados com uma proteína recombinante InlA (rInlA) concomitantemente com L. monocytogenes inativadas por fervura. Os MAbs gerados demonstraram excelente reatividade por ELISA indireto, Western blot e imunofluorescência. O MAb anti-InlA 2D12 marcado com Cy5 foi usado como anticorpo de detecção de L. monocytogenes, no sistema tipo sanduíche de sensor de fibra óptica. Usando MAb-2D12 como anticorpo de captura nas fibras ópticas, obteve-se um limite de detecção de ~3 x 102 CFU.mL-1, e um limite de detecção de ~1 x 105 CFU.mL-1 foi visualizado com MAb-3F8 como captura. Os MAbs anti-InlA 2D12 e anti-Listeria 3F8 foram posteriormente utilizados para sensibilizar esferas paramagnéticas e testados na separação imunomagnética (IMS) de L. monocytogenes em culturas puras, e em queijo e salsichas tipo hotdog artificialmente contaminados. Após a captura por IMS, as bactérias foram liberadas, incubadas com a fibra óptica ou plaqueadas em agares para contagem. Em paralelo, a confirmação da captura de L. monocytogenes foi realizada por PCR quantitativo em tempo real e por light-scattering technology (BARDOT). Utilizando IMS para separar e concentrar L. monocytogenes, seguido da utilização em plataforma de fibra óptica, foi possível realizar a detecção em menos de 22 horas, de aproximadamente 40 UFC/g de L. monocytogenes em presença de L. innocua, em queijo e salsicha artificialmente contaminados. Além disso, a proteína alvo do MAb3F8 foi identificado como frutose 1,6-bifosfato aldolase através de espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS). Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que a utilização em conjunto dos sistemas de IMS e fibra óptica com os MAb-2D12 e MAb3F8, foram confiáveis e rápidos, e assim, podendo ser empregados em imunoensaios de rotina para detecção de L. monocytogenes em alimentos. Contudo, ambos MAbs possuem ainda grande potencial para serem mais explorados em outras plataformas de biossensores, assim como, em outros imunoensaios de detecção e funcionalidade de InlA e FBA em Listeria
URI
https://guaiaca.ufpel.edu.br/handle/123456789/1299
Collections
  • PPGBiotec: Dissertações e Teses [191]

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