Construção de marcador auxotrófico em Mycobacterium bovis BCG, de uma cepa knockout para DPPD e estudo proteômico da tuberculina
Fecha
2008-02-28Metadatos
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Mycobacterium bovis BCG tem o potencial para ser um vetor efetivo para
vacinas recombinantes multivalentes. No entanto, existem dois problemas
quanto a sua utilização como vetor vacinal. O primeiro é a presença de genes
que conferem resistência a antibióticos nos vetores utilizados para
transformação genética. O segundo é a limitação de uso de BCG em animais,
principalmente por comprometer o teste de tuberculina, utilizado como
diagnóstico de tuberculose, o qual se baseia em reação de hipersensibilidade
ao PPD (Derivado Protéico Purificado). Neste trabalho desenvolvemos e
avaliamos a complementação auxotrófica como novo marcador de seleção,
fizemos a caracterização das proteínas componentes de amostras de PPD
aviário e bovino e desenvolvemos um mutante de BCG por recombinação
homóloga. Para o uso de complementação auxotrófica como marcador de
seleção, uma cepa de BCG auxotrófica para o aminoácido leucina foi
construída por knockout do gene leuD por recombinação homóloga. A
expressão do gene leuD em um plasmídio atuou como marcador de seleção
nas cepas auxotróficas de M. bovis BCG leuD e M. smegmatis mc2144. A
seleção por complementação de BCG auxotrófica se mostrou equivalente à
seleção por resistência a antibiótico, com a vantagem adicional de proporcionar
maior estabilidade do vetor plasmidial, já que a pressão seletiva é mantida
mesmo durante multiplicação da bactéria in vivo. A identificação das proteínas
que compõem o PPD foi feita por espectrometria de massa utilizando-se LCMS/
MS (cromatografia líquida associada à espectrometria de massa em
tandem). Foram identificadas 147 proteínas entre 5 amostras de PPD (2 PPD
bovino e 3 PPD aviário). O PPD bovino teve um número maior de proteínas
comparado ao PPD aviário. Foi identificado um grupo de 28 proteínas
presentes em PPD bovino, mas ausentes em PPD aviário. Além disso, 5
proteínas encontradas no PPD estão ausentes em M. bovis BCG. Estes são de
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especial interesse, pois poderão vir a contribuir para o desenvolvimento de um
teste de diagnóstico mais específico, e possivelmente capaz de diferenciar
indivíduo vacinado com BCG e infectado com o bacilo da tuberculose. Um
mutante de M. bovis BCG Pasteur foi construído. O gene Mb0092 (dppd) foi
alvo de inativação gênica por recombinação homóloga. Seqüências que
flanqueiam o gene alvo foram clonadas em um vetor suicida. Duplo crossover
foi selecionado utilizando sacB. O genótipo mutante foi determinado por PCR e
por Southern blot. Esta cepa poderá ser utilizada como vacina em animais,
quando o diagnóstico for feito com DPPD recombinante. Os resultados obtidos
apresentam alternativas para os problemas envolvidos quanto à utilização de
M. bovis BCG como vacina recombinante. O sistema de seleção por
complementação auxotrófica foi estável, e pode ser empregado na expressão
de antígenos heterólogos em BCG. A identificação dos principais componentes
protéicos do PPD e o desenvolvimento da cepa mutante de BCG possibilitam o
desenvolvimento de testes diagnósticos diferencias, permitindo a utilização de
BCG como vacina também em animas.